摘要：本研究旨在利用磷酸鈣鹽沉淀法建立穩(wěn)定的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，以探索血管緊張素II受體1型（AT1）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（CaMKII）的相互作用。通過該方法，成功將AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞，并觀察到其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及功能。該方法為進(jìn)一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺(tái)。

引言

磷酸鈣鹽沉淀法作為一種經(jīng)典的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，因其操作簡便、成本低廉而被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中。該方法通過將質(zhì)粒DNA與磷酸鹽緩沖液混合，并加入氯化鈣溶液形成磷酸鈣-DNA復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠黏附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立對(duì)于研究多個(gè)基因間的相互作用具有重要意義。本研究旨在利用磷酸鈣鹽沉淀法搭建表達(dá)AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞模型，以觀察其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及功能，為進(jìn)一步研究其相互作用提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 材料

• 細(xì)胞株：COS7細(xì)胞株，購自日本千葉大學(xué)。

• 質(zhì)粒：帶HA-tag的AT1質(zhì)粒（WT，小鼠來源）、帶V5-tag的CaMKII質(zhì)粒（δB/WT或無功能活性抑制體DN型，小鼠來源），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、純化和篩選。

• 試劑：磷酸鈣鹽沉淀法轉(zhuǎn)染試劑；EcoRI、NotI、BamHI內(nèi)切酶；兔抗人CaMKII、山羊抗人AT1、兔抗HA、小鼠抗V5抗體；GAPDH、HRP標(biāo)記二抗、熒光二抗；瓊脂糖；DMEM培養(yǎng)基（低糖型）、胎牛血清（FBS）；ECL顯影劑；質(zhì)粒抽提試劑盒；膜蛋白抽提試劑盒；Western和IP細(xì)胞裂解液。

• 儀器：瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀；聚丙烯酰胺凝膠電泳及半干法電轉(zhuǎn)儀、聚丙烯酰胺凝膠成像儀；CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)平板、微量移液器等。

2. 方法

2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增、篩選及抽提

利用大腸桿菌JM109進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，通過篩選和抽提獲得高純度質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的濃度和純度通過分光光度計(jì)檢測，確保無蛋白和RNA污染。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

COS7細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中。細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長至約70%-80%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.3 磷酸鈣鹽沉淀法轉(zhuǎn)染

1. 在無菌的離心管中，將適量的AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質(zhì)粒DNA與等體積的2 M CaCl2溶液混合。

2. 緩慢地將DNA-CaCl2混合液滴加到含有2×HBS緩沖液的離心管中，同時(shí)輕輕吹打，使DNA與磷酸鈣形成微小的復(fù)合物。

3. 室溫靜置20-30分鐘，讓磷酸鈣-DNA復(fù)合物逐漸形成。

4. 將制備好的磷酸鈣-DNA復(fù)合物逐滴均勻地加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，輕輕晃動(dòng)使復(fù)合物均勻分布。

5. 將細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8小時(shí)，然后更換新鮮培養(yǎng)基。

2.4 檢測轉(zhuǎn)染效果

轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行基因活性的檢測。采用免疫熒光法（IF）和免疫印跡法（WB）測定細(xì)胞表面表達(dá)的AT1（及其所帶的HA-tag）、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的CaMKII/WT或CaMKII/DN（及其所帶的V5-tag）。給予轉(zhuǎn)染細(xì)胞以血管緊張素II（AngII）、AT1受體拮抗劑（ARB）+AngII等刺激，通過WB測定磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）的改變。

結(jié)果

1. 質(zhì)粒酶切及電泳鑒定

質(zhì)粒DNA經(jīng)過EcoRI和NotI雙酶切后，通過瓊脂糖電泳鑒定目的DNA片段。電泳結(jié)果顯示，酶切后的質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)出預(yù)期的長度，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2. 轉(zhuǎn)染效果檢測

2.1 免疫熒光法（IF）

轉(zhuǎn)染后的COS7細(xì)胞通過IF檢測AT1和CaMKII的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質(zhì)粒的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的陽性熒光反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則無熒光信號(hào)。這表明AT1和CaMKII成功表達(dá)在COS7細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

2.2 免疫印跡法（WB）

通過WB檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AT1和CaMKII的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/WT質(zhì)粒的細(xì)胞在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則無相應(yīng)條帶。此外，給予AngII刺激后，轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/WT的細(xì)胞產(chǎn)生p-ERK升高反應(yīng)，這種反應(yīng)可被ARB預(yù)處理消除；而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/DN的細(xì)胞無類似反應(yīng)。這表明AT1和CaMKII在COS7細(xì)胞中成功表達(dá)并具有相關(guān)功能。

討論

1. 磷酸鈣鹽沉淀法的優(yōu)勢與局限性

磷酸鈣鹽沉淀法作為一種經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)染方法，具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)勢。該方法適用于大多數(shù)類型的細(xì)胞，尤其對(duì)于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是常用并的方法。然而，磷酸鈣鹽沉淀法的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，且容易受到實(shí)驗(yàn)條件的影響，如pH值的微小變化都可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的波動(dòng)。此外，該方法還存在一定的細(xì)胞毒性，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在實(shí)驗(yàn)中需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保轉(zhuǎn)染效果。

2. 雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的意義

雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立對(duì)于研究多個(gè)基因間的相互作用具有重要意義。本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法將AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞，并觀察到其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及功能。這一模型的建立為進(jìn)一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺(tái)。通過該模型，可以深入探究AT1和CaMKII在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的相互作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。

3. 實(shí)驗(yàn)策略與創(chuàng)新

本研究在實(shí)驗(yàn)策略上采用了磷酸鈣鹽沉淀法進(jìn)行雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并利用IF和WB等方法對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行檢測。這一策略不僅操作簡便、成本低廉，而且具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性。在實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新方面，本研究成功建立了表達(dá)AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞模型，為后續(xù)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，本研究還通過給予AngII和ARB等刺激，觀察了轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

4. 應(yīng)用前景

本研究建立的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型在相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。首先，該模型可用于深入研究AT1和CaMKII在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的相互作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。其次，該模型還可用于篩選和評(píng)估針對(duì)AT1和CaMKII的藥物作用效果，為新藥研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，該模型還可用于其他相關(guān)基因的研究，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的平臺(tái)和工具。

結(jié)論

本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法建立了表達(dá)AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞模型，并觀察到其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及功能。這一模型的建立為進(jìn)一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺(tái)。通過該模型，可以深入探究AT1和CaMKII在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的相互作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。本研究不僅在實(shí)驗(yàn)策略上具有創(chuàng)新性，而且在相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。未來，我們將繼續(xù)利用該模型進(jìn)行深入研究，以期取得更多的研究成果。