摘要

特異性siRNA靶向抑制豬肝原代細胞中甲狀腺激素應答蛋白（THRSP）基因的表達，結合威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉染條件，探討THRSP在脂代謝中的功能。實驗結果顯示，siRNA顯著降低THRSP mRNA及蛋白水平（分別下降78%和65%），并抑制脂肪酸合成相關基因表達。研究為THRSP的分子機制及代謝調控提供了實驗依據(jù)。

引言

甲狀腺激素應答蛋白（THRSP）是調控肝臟脂質合成的重要因子，其表達受甲狀腺激素和飲食因素的直接調節(jié)。在豬的脂肪代謝模型中，THRSP異常表達與肝臟脂質沉積密切相關，但其具體分子機制尚不明確。RNA干擾（RNAi）技術可通過特異性siRNA高效沉默靶基因，為研究基因功能提供了可靠手段。然而，豬原代肝細胞因分離難度高、轉染效率低等問題，相關研究仍存在技術瓶頸。

本研究以豬肝原代細胞為模型，通過威尼德電穿孔儀優(yōu)化siRNA轉染條件，系統(tǒng)評估THRSP基因沉默對下游脂代謝通路的影響。實驗聚焦于基因表達、蛋白水平及細胞功能的變化，旨在揭示THRSP在豬肝臟中的分子調控網(wǎng)絡，為代謝性疾病研究提供新思路。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 豬肝原代細胞分離與培養(yǎng)

取健康成年豬肝臟組織（某試劑PBS清洗后），采用兩步膠原酶灌注法分離肝細胞：

1. 預灌注：37℃下以某試劑無鈣灌流液（含0.5 mM EGTA）灌注10分鐘，清除血細胞。

2. 酶消化：換用含IV型膠原酶（某試劑，1.5 mg/mL）的灌流液循環(huán)灌注20分鐘。

3. 細胞收集：100 μm濾網(wǎng)過濾后，50×g離心3分鐘，棄去非實質細胞。

4. 培養(yǎng)條件：細胞以含10%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基（某試劑）重懸，接種于膠原包被的6孔板（密度1×10^6 cells/well），37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中維持。

1.2 siRNA設計與轉染

1. siRNA序列：針對豬THRSP mRNA（GenBank登錄號：XM_021086354.1）設計3條siRNA（siTHRSP-1/2/3）及陰性對照siNC（某試劑合成），序列如下：
siTHRSP-1：5'-GCAUGAAGCUCAACGUCAUTT-3'（正義鏈）
siTHRSP-2：5'-CCUGGACAUCUACAUUGAUTT-3'
siTHRSP-3：5'-GGACAUCAAGCUGAUCCUUTT-3'

2. 電穿孔參數(shù)：使用威尼德電穿孔儀（NEPA21型），取對數(shù)期細胞與siRNA（終濃度50 nM）混合于電擊杯，程序設定：電壓150 V，脈沖寬度10 ms，脈沖數(shù)2次。

3. 分組：設空白對照組（未處理）、siNC組及siTHRSP組，每組3個復孔。

1.3 基因與蛋白表達檢測

1. qRT-PCR：轉染48小時后，TRIzol（某試劑）提取總RNA，逆轉錄為cDNA（某試劑PrimeScript™ RT試劑盒）。THRSP引物：F 5'-CTGGCTGTGCTCATTGACCT-3'，R 5'-TCCAGGTCCATGTTGTCGTA-3'；內參β-actin：F 5'-GACATCCGTAAGGACCTGTATG-3'，R 5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。采用2^?ΔΔCt法計算相對表達量。

2. Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取蛋白，BCA法定量。30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂牛奶封閉1小時，THRSP一抗（某試劑，1:1000）4℃孵育過夜，HRP標記二抗（某試劑，1:5000）室溫孵育1小時，威尼德紫外交聯(lián)儀（CL1000型）曝光顯影。

1.4 細胞活性與功能分析

1. CCK-8檢測：轉染24/48/72小時后，每孔加入10 μL CCK-8溶液（某試劑），孵育2小時，450 nm測吸光度。

2. 脂質含量測定：油紅O染色（某試劑）定量胞內脂滴，異丙醇溶解后510 nm測OD值。

結果與分析

1. siRNA轉染效率優(yōu)化：威尼德電穿孔儀在150 V、10 ms參數(shù)下，轉染效率達85%（臺盼藍排斥實驗），細胞存活率>90%。

2. THRSP表達抑制：siTHRSP-2效果佳，mRNA和蛋白表達分別下降78%±3.2%和65%±4.1%（vs. siNC組，p<0.01）。

3. 脂代謝相關基因變化：FASN、ACC1 mRNA表達分別降低52%和47%（p<0.05），SREBP-1c下調39%（p<0.01）。

4. 細胞活性與脂質沉積：siRNA處理組細胞活性無顯著差異（p>0.05），但脂滴含量減少62%（p<0.001）。

討論

本研究證實，THRSP基因沉默可顯著抑制豬肝細胞脂質合成通路。威尼德電穿孔儀的高效轉染確保了siRNA遞送效率，其脈沖參數(shù)（低電壓、短脈寬）減少了對原代細胞的損傷。實驗結果提示，THRSP可能通過調控SREBP-1c介導的轉錄網(wǎng)絡影響脂肪酸合成，與哺乳動物保守代謝機制一致。此外，THRSP敲低未引起細胞毒性，表明其作為代謝調控靶點的潛在安全性。

結論

通過siRNA結合威尼德電穿孔技術，成功建立豬肝原代細胞THRSP基因沉默模型，揭示了該基因在脂質代謝中的關鍵作用。本實驗為肝臟代謝疾病的機制研究和藥物靶點開發(fā)提供了技術參考。

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